其不只能作为聚糖的辨识和检查测验探针,组装体通过三个双成效DNA探针与电极上时限信号链的组合

图4 基于多肽构象探针构建的肿瘤侵袭标志蛋白活性检测

AMS免疫分析方法示意图及检测流程如图1所示。利用该分析平台,凝血酶加标样品的检测限(LOD)分别为10.9
zmol(PBS)和35.1
zmol(血清)。该方法实现了血清样品中CA125等生物标志物的检测,有望用于卵巢癌和乳腺癌的早期诊断。该平台还可实现低至25个细胞水平的OVCAR-3和MCF-7细胞表面的重要三种生物标志物(CA125、CEA和EpCAM)的同时、原位表达差异测定,显示了超高的灵敏度和多目标同时检测能力,且具有普适性和可拓展性。

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近期,国际著名期刊《Chemical
Science》以封面文章报道了我校生命科学学院李根喜教授课题组在生物分子工程及临床检验应用方面的一项成果,并且被作为热点论文加以介绍,论文题名为“Improvement
of enzyme-linked immunosorbent assay for the multicolor detection of
biomarkers”,Chemical Science, 2016, 7, 3011-3016。

北京大学化学与分子工程学院刘虎威/白玉副教授课题组设计合成了新型罗丹明类MS标签,并基于此发展了膜蛋白生物标志物的超高灵敏度、高通量、多目标及操作简便的常压敞开式质谱(AMS)免疫分析新方法。该方法可实现微升级体液中或几十个细胞表面的疾病蛋白标志物的原位检测,检测灵敏度达zeptomole(zmol)水平。相关成果以“Ultrasensitive
Ambient Mass Spectrometry Immunoassays: Multiplexed Detection of
Proteins in Serum and on Cell Surfaces”为题在Journal of American
Chemical Society
在线发表(DOI:
10.1021/jacs.8b10853);此外,该课题组针对聚糖的检测,设计了双功能激光可裂解金纳米质谱探针(LCMP),其既能作为聚糖的识别和检测探针,又可作为激光解吸附的基质,直接实现后续的MS检测和成像。该探针成功用于肿瘤患者组织表面聚糖的MS成像,有望为疾病的诊断和基于MS的可视化成像提供有力工具。相关成果以“Bifunctional
cleavable probe for in-situ multiplexed glycan detection and imaging
using mass spectrometry”为题在Chemical Science在线发表(DOI:
10.1039/C8SC04642E)。

图2:基于DNA“步行者”的电化学传感器用于蛋白质分析示意图。

刘虎威/白玉课题组长期致力于复杂生物样品的分离和检测研究,旨在发展基于新型纳米分离介质的高效样品处理方法,基于质谱的高灵敏度、高通量、高选择性的分析新方法以及临床组学研究。上述论文通讯作者为白玉,第一作者分别为2015级博士生徐姝婷(J.
Am. Chem. Soc
,DOI:
10.1021/jacs.8b10853)和2014级博士研究生马雯(Chem. Sci,DOI:
10.1039/C8SC04642E)。研究工作得到国家自然科学基金委和科技部国家重点研发计划的资助。

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针对聚糖的原位检测及MS成像分析,课题组设计了基于凝集素识别和三种PEG类小分子MS信号分子分别标记的双功能LCMP探针(图2)。该探针将对聚糖的检测转化为对修饰的大量PEG类MS报告基团的检测,从而克服了聚糖离子化效率低、检测灵敏度低、谱图解析困难等问题。所设计的识别单元适用于凝集素、抗体和核酸适配体等体系。利用上述探针对细胞表面的单糖(甘露糖、末端唾液酸和N-乙酰葡萄糖胺)开展了原位分析,以及肿瘤患者组织表面聚糖的MS成像。成像结果直观反映了癌组织和癌旁组织、同一组织不同病理变化和组织中不同微观结构区域的聚糖含量变化,不仅有助于揭示各类肿瘤发生发展过程中聚糖含量的变化,也有望应用于临床诊断和肿瘤标志物筛选。

图1:pH响应的纳米探针用于肿瘤标志蛋白的多色分析。

图2 双功能激光可裂解质谱探针的合成及其在聚糖检测及MS成像中的应用

以上研究得到国家自然科学基金重点项目、以及教育部创新研究团队的经费支持。

作为临床常见的生物标志物和药物靶标,膜蛋白和聚糖等生物分子参与诸多生命活动过程,其异常表达与疾病的发生发展息息相关。因此,对体液、细胞及组织上膜蛋白和聚糖表达水平的准确、快速检测及可视成像分析具有重要的科学意义和实用价值。常用的酶联免疫测定以及基于荧光或电化学的方法虽然能够满足检测灵敏度的要求,但存在谱带重叠、背景干扰严重、标记探针数量有限而难以实现多目标的同时检测等缺陷。质谱(MS)具有高质量分辨率优势,可以满足单点多目标同时检测的需求,但基于MS的蛋白质和聚糖直接检测也存在离子化效率低、检测灵敏度有限的问题。可裂解探针技术通过设计特异性的探针识别和标记目标待测物,将对系列目标待测物的检测转化为探针上标记的MS报告基团的检测,通过这一信号放大过程使得检测灵敏度大大提高。

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图1 常压敞开式质谱(AMS)免疫分析方法及测定流程示意图

再如,肿瘤分型与分期的鉴定对确定治疗方案和判断病人的预后有着非常重要的意义,目前临床上常用的分析方法是组织学病理检测,但是基于少量瘤组织切片进行分级,常常难以准确反映整个肿瘤的分化程度,而且容易受到分析人员主观因素的干扰,使分级的价值受到影响,因此,他们提出了一种由石墨烯与DNA修饰的金纳米颗粒组成的比色传感器阵列,可以快速、准确的鉴定出非小细胞肺癌两种最常见的亚型——肺腺癌与肺鳞癌及其三种分期,而且检测过程简单,无需仪器即可完成肉眼可分辨的检测,方便实际应用,相关成果以“An
array-based approach to determine different subtype and differentiation
of non-small cell lung cancer”为题发表于Theranostics, 2015, 5, 62-70。

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李根喜教授课题组长期从事生物分子工程及临床检测应用方面的研究工作,近期与南京医科大学附属第一医院、附属第二医院、以及南京大学附属鼓楼医院的有关专家合作,在疾病标志蛋白分析新方法及临床检验应用方面取得了系列进展,为临床医学诊断和治疗提供了全新的技术路径。例如,疾病蛋白标志物的发现为相关疾病(如肿瘤、心血管疾病等)的快速、准确诊断带来了新的契机,然而在疾病发生的早期阶段,这些标志物的浓度很低,现有的检测方法往往对此无能为力,为此,李根喜教授课题组利用“DNA步行者”的基本原理,设计了一种全新的电化学生物传感器,可以用于多种临床上常用疾病标志物的灵敏检测。在这一工作中,他们通过设计一种双功能DNA探针,其一端的功能区域可以特异性地识别待测物,另一端的功能区域则能够与电极界面上事先修饰好的信号DNA短链互补配对形成DNA核酶。当待测物存在时,多个双功能DNA探针可以与待测物形成类似于“DNA步行者”的组装体,在邻位效应的帮助下,组装体通过多个双功能DNA探针与电极上信号链的结合,形成完整的核酶切断信号链,而热稳定性的变化促使双功能DNA探针脱离下来,继续结合下一个信号链并将其切割,从而形成有效的放大效应。研究结果证明该检测体系可实现大范围(10-18-10-9M)和高灵敏度疾病标志物的检测,为疾病的早期诊断提供了有利的工具,同时,该研究也为利用DNA机器来构建蛋白质电化学检测方法提供了新的设计思路。相关成果以“Simple
electrochemical sensing of attomolar protein using fabricated complexes
with enhanced surface binding avidity”为题发表于Chemical Science, 2015,
6, 4311-4317。

近日,《Scientific
report》报道了李根喜教授课题组的另外一项成果“Enzymatically Regulated
Peptide Pairing and Catalysis for the Bioanalysis of Extracellular
Prometastatic Activities of Functionally Linked Enzymes”
,www.nature.com/articles/srep25362。该课题组利用新型生物传感分子探针,针对肿瘤的侵袭过程,发展了酶活性与生物学功能分析的生物传感新技术。在这一研究工作中,他们通过将各种蛋白酶、转肽酶的活性变化转化为卷曲螺旋多肽双链的互补配对、解离等明显的构象变化,并进而用这种构象变化控制多肽与金属离子的配位作用,最终将酶活性变化转化为过渡金属离子催化的化学级联放大反应,从而可产生灵敏的生物传感信号。利用该方法,他们在乳腺癌的临床样本中可以观测到血浆素、组织转肽酶及酪氨酸羟化酶等的活性与肿瘤病情发展阶段所呈现出的平行性。该检测方法灵敏度高,且能够分析多种介导肿瘤侵袭、癌基质变性的关键蛋白质的活性,未来肿瘤诊断和预后提供了更加可靠的技术保证。

其不只能作为聚糖的辨识和检查测验探针,组装体通过三个双成效DNA探针与电极上时限信号链的组合。酶联免疫分析是生物医学研究及临床检验中最常用的技术手段,但存在检测信号单一、检测灵敏度较低等问题。李根喜教授课题组首次实现了酶联免疫分析的同时多色检测,极大地弥补了传统酶联免疫测定中效率低下的问题,并且证实了联合分析病人血清中三种肿瘤标志物,可以显著提高肺癌的检出率,为癌症的早期诊断和对症施治提供了非常有益的信息。在这一工作中,他们通过将抗体分子修饰在富含羧基的石墨烯边缘,然后再通过π-π相互作用和疏水作用力将多种变色分子如孔雀石绿、甲基红、酚酞、百里酚酞分别吸附到石墨烯表面,从而制得多种pH响应的变色纳米探针,因此实现了多种肿瘤标志蛋白的多色分析。

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(生命科学院 科学技术处)

图3:基于ssDNA-GNPs-GO体系的比色阵列用于肺癌分型与分期的鉴别。

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